PA28γ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403397-ACT

PSME3 codifica la subunità attivatrice del proteasoma umano PA28γ, un regolatore nucleare della funzione del proteasoma 20S che modula il turnover proteico indipendente da ATP e ubiquitina. PA28γ contribuisce al controllo della proteostasi, influisce sulla progressione del ciclo cellulare e sulle risposte allo stress, e condiziona la degradazione di specifiche proteine regolatorie che plasmano i programmi trascrizionali. Attraverso il suo ruolo nel processamento mediato dal proteasoma, PA28γ si interseca con vie che governano la risposta al danno del DNA, la regolazione associata alla cromatina e la segnalazione infiammatoria. In letteratura, un’alterata espressione o attività di PSME3 è stata associata a proliferazione deregolata e a fenotipi oncogenici, a sostegno del suo impiego come nodo meccanicistico nella biologia del cancro e negli studi sulla via del proteasoma.

PA28γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PSME3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PA28γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PSME3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PSME3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PA28γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PSME3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PA28γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PA28γ nelle cellule tumorali con espressione di PSME3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.