p41-ARCb Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405027-ACT

ARPC1B codifica p41-ARCb, una subunità regolatoria del complesso Arp2/3 che promuove la polimerizzazione ramificata dell’actina, necessaria per la formazione dei lamellipodi, l’endocitosi e il rimodellamento dinamico del citoscheletro corticale. Accoppiando la nucleazione dell’actina agli input di segnalazione, ARPC1B sostiene processi quali la migrazione cellulare, l’organizzazione della sinapsi immunologica e il traffico vescicolare. Alterazioni della funzione di ARPC1B sono associate a risposte dipendenti dall’actina deregolate in contesti ematopoietici e di cellule immunitarie, rendendolo rilevante per lo studio del controllo del citoscheletro nell’infiammazione e nella difesa dell’ospite. ARPC1B è quindi frequentemente studiato nelle vie che governano i cambiamenti di forma cellulare, l’adesione e la segnalazione indotta dai recettori che dipendono dall’attività di Arp2/3.

p41-ARCb Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ARPC1B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p41-ARCb Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ARPC1B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ARPC1B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p41-ARCb. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ARPC1B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p41-ARCb nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p41-ARCb nelle cellule tumorali con espressione di ARPC1B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.