Orexin-A CRISPR Activationプラスミド (h): sc-400357-ACT

ヒトのHCRTはプレプロオレキシンをコードしており、これがプロテアーゼにより切断・加工されてオレキシンAという神経ペプチドが生成される。オレキシンAは主にOX1RおよびOX2R（HCRTR1/HCRTR2）を介してシグナルを伝え、覚醒、睡眠–覚醒の安定性、摂食行動、報酬処理、自律神経系の恒常性を調節する。オレキシンAは、Gq/11およびGi/oに共役したシグナル伝達を含むGPCR駆動経路を活性化し、細胞内カルシウム動態、MAPK/ERK活性、ならびに視床下部および脳幹回路における神経細胞の興奮性を調節する。オレキシンシグナルの異常は、ナルコレプシーなどの睡眠障害と強く関連し、さらに代謝バランスやストレス応答性に関わるより広範な表現型とも結び付いている。生物医学研究では、HCRT／オレキシンAは、神経調節ネットワーク機能の解明、エネルギー状態の回路レベルでの統合、ならびに覚醒や動機づけに関連する転写プログラムの解析に用いられている。

Orexin-A CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性HCRTの発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

Orexin-A CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における HCRT 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はHCRT転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性Orexin-Aの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のHCRT遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるOrexin-A依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびHCRT発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるOrexin-A経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。