oligophrenin-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403694-ACT

OPHN1 codifica l’oligofrenina-1, una proteina attivatrice della GTPasi Rho (RhoGAP) che riduce la segnalazione di RhoA, Rac1 e Cdc42 per coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina, il traffico di membrana e la struttura sinaptica. Attraverso la modulazione delle vie della famiglia Rho, l’oligofrenina-1 influenza la crescita dei neuriti, la morfogenesi delle spine dendritiche e i processi endocitici che supportano la connettività e la plasticità neuronale. Varianti con perdita di funzione in OPHN1 sono associate a fenotipi neuroevolutivi legati al cromosoma X, inclusa la disabilità intellettiva con anomalie strutturali cerebrali, evidenziandone l’importanza nella formazione dei circuiti. Queste caratteristiche rendono OPHN1 un nodo utile per studiare la dinamica del citoscheletro e le reti di segnalazione che collegano le piccole GTPasi alla funzione sinaptica.

oligophrenin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di OPHN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

oligophrenin-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus OPHN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione OPHN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di oligophrenin-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus OPHN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da oligophrenin-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via oligophrenin-1 nelle cellule tumorali con espressione di OPHN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.