OATP8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402371-ACT

SLCO1B3 codifica il trasportatore umano di anioni organici OATP8 (OATP1B3), un trasportatore di membrana di ingresso che media l’assorbimento, indipendente dal sodio, di diversi anioni organici endogeni e xenobiotici. È altamente rilevante per i processi di trasporto epatico ed epiteliale che determinano l’esposizione cellulare ad acidi biliari, coniugati della bilirubina, metaboliti degli ormoni steroidei e numerosi composti di tipo farmacologico, influenzando così le vie di detossificazione e di eliminazione metabolica. Un’alterata espressione di SLCO1B3 o la sua mislocalizzazione possono rimodellare la disponibilità intracellulare dei substrati e la segnalazione a valle associata alla risposta agli xenobiotici, alla gestione dello stress ossidativo e all’omeostasi metabolica. Un’attività anomala di OATP1B3 e pattern di espressione ectopica sono stati riportati in molteplici tumori e disturbi associati al fegato, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici su fenotipi regolati dai trasportatori e sulla variabilità farmacogenomica.

OATP8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLCO1B3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OATP8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLCO1B3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLCO1B3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OATP8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLCO1B3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OATP8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OATP8 nelle cellule tumorali con espressione di SLCO1B3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.