NT-3 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421978-ACT

Il gene murino Ntf3 codifica la neurotrofina-3 (NT-3), un fattore di crescita secreto che regola la sopravvivenza neuronale, la differenziazione e la connettività sinaptica durante lo sviluppo e nei tessuti adulti. NT-3 segnala principalmente attraverso il recettore tirosin-chinasico TRKC/NTRK3, attivando le cascate MAPK/ERK, PI3K–AKT e PLCγ che modellano la guida assonale, l’estensione dei neuriti e la plasticità dipendente dall’attività. Al di fuori del sistema nervoso, NT-3 influenza la formazione dei circuiti propriocettivi e il mantenimento dei nervi periferici, e può modulare le interazioni neuroimmuni all’interno dei microambienti tissutali. La deregolazione della segnalazione delle neurotrofine è rilevante per studi su fenotipi neurosviluppativi, neurodegenerazione e risposte a lesioni nervose, in cui un supporto trofico alterato e uno squilibrio delle vie recettoriali influenzano il destino cellulare e la connettività.

NT-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ntf3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NT-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ntf3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ntf3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NT-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ntf3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NT-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NT-3 nelle cellule tumorali con espressione di Ntf3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.