NRAMP 1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421957-ACT

Slc11a1 kodiert NRAMP1, einen Transporter in der phagosomalen Membran, der den Fluss zweiwertiger Metallionen – darunter Eisen und Mangan – in Makrophagen und anderen myeloiden Zellen reguliert. Indem NRAMP1 die Metallverfügbarkeit und die Bedingungen im Phagolysosom mitprägt, beeinflusst es antimikrobielle Effektorfunktionen, den Umgang mit oxidativem Stress sowie nachgeschaltete angeborene Immun-Signalprogramme, die Entzündungsreaktionen koordinieren. In Mausmodellen wurde Slc11a1-Variation mit einer veränderten Anfälligkeit gegenüber intrazellulären Pathogenen und mit immunvermittelter Pathologie in Verbindung gebracht – über Effekte auf den Aktivierungszustand von Makrophagen und auf Zytokinnetzwerke. Diese Eigenschaften machen NRAMP1 zu einem nützlichen Ausgangspunkt, um Wirt-Pathogen-Interaktionen, die Metallhomöostase in Phagozyten und die immunmetabolische Regulation zu untersuchen.

NRAMP 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Slc11a1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NRAMP 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Slc11a1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Slc11a1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NRAMP 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Slc11a1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NRAMP 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NRAMP 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Slc11a1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.