NRAMP 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421957-ACT

Slc11a1 codifica NRAMP1, un trasportatore di membrana dei fagosomi che regola il flusso di ioni metallici bivalenti, inclusi ferro e manganese, all’interno dei macrofagi e di altre cellule mieloidi. Modulando la disponibilità dei metalli e le condizioni del fagolisosoma, NRAMP1 influenza le funzioni effettrici antimicrobiche, la gestione dello stress ossidativo e i programmi di segnalazione dell’immunità innata a valle che coordinano le risposte infiammatorie. Nei modelli murini, varianti di Slc11a1 sono state associate a una suscettibilità alterata ai patogeni intracellulari e a patologie guidate dal sistema immunitario, attraverso effetti sullo stato di attivazione dei macrofagi e sulle reti di citochine. Queste proprietà rendono NRAMP1 un utile punto di partenza per studiare le interazioni ospite–patogeno, l’omeostasi dei metalli nei fagociti e la regolazione immunometabolica.

NRAMP 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slc11a1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NRAMP 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slc11a1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slc11a1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NRAMP 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slc11a1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NRAMP 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NRAMP 1 nelle cellule tumorali con espressione di Slc11a1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.