NPR-B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401861-ACT

NPR2 codifica per il recettore del peptide natriuretico B (NPR-B), una guanilato ciclasi di membrana che lega il peptide natriuretico di tipo C per generare cGMP e attivare la segnalazione a valle dipendente da PKG. Questa via regola l’ossificazione endocondrale, la proliferazione e la differenziazione dei condrociti, oltre a un controllo più ampio dei programmi di crescita cellulare tramite la modulazione, mediata da cGMP, del trasporto ionico e delle risposte trascrizionali. La segnalazione di NPR2 si interseca con le reti dello sviluppo scheletrico e con l’omeostasi della cartilagine di accrescimento; perturbazioni genetiche o funzionali sono associate a disturbi della crescita lineare e della biologia della cartilagine. Oltre ai fenotipi dello sviluppo, un’alterazione della segnalazione peptide natriuretico–cGMP è rilevante anche negli studi sulla regolazione del tono vascolare e sul rimodellamento tissutale in modelli cellulari umani.

NPR-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NPR2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NPR-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NPR2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NPR2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NPR-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NPR2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NPR-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NPR-B nelle cellule tumorali con espressione di NPR2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.