NFKBIA/IkB alpha Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400034-ACT

NFKBIA codifica IκBα, uno dei principali inibitori citoplasmatici di NF-κB, che si lega ai complessi RELA/p50 e ne limita la traslocazione nel nucleo in condizioni basali. In seguito a stimolazione da parte di citochine, ligandi dei recettori Toll-like o segnali di stress, IκBα viene fosforilata dal complesso IKK, ubiquitinata e degradata, consentendo una rapida trascrizione NF-κB–dipendente di programmi infiammatori, immunitari e di sopravvivenza. NFKBIA partecipa anche al controllo a feedback negativo perché è esso stesso un gene bersaglio di NF-κB, contribuendo a riportare l’attività della via a livelli di base dopo la segnalazione. Un’espressione deregolata di NFKBIA o un turnover alterato di IκBα sono stati collegati a infiammazione cronica, disfunzioni immunitarie e biologia tumorale guidata da NF-κB, rendendolo un nodo comune negli studi sulla segnalazione innata e sulle decisioni di destino cellulare.

NFKBIA/IkB alpha Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NFKBIA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NFKBIA/IkB alpha Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NFKBIA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NFKBIA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NFKBIA/IkB alpha. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NFKBIA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NFKBIA/IkB alpha nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NFKBIA/IkB alpha nelle cellule tumorali con espressione di NFKBIA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.