nephrocystin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404375-ACT

NPHP1 codifica a nefrocistina, uma proteína adaptadora associada aos cílios que se localiza no cílio primário e nos compartimentos do centrossoma/corpo basal, onde dá suporte à montagem ciliar, ao tráfego intraciliar e à competência de sinalização. A nefrocistina coordena complexos multiproteicos envolvidos na polaridade de células epiteliais, na mecanossensação e na organização do citoesqueleto, conectando a estrutura do cílio a vias a jusante que regulam a diferenciação e a homeostase tecidual. A disfunção de NPHP1 está fortemente associada a ciliopatias relacionadas à nefronoftise e a fenótipos sindrômicos que surgem de sinalização ciliar prejudicada e da perda de integridade epitelial. Por isso, NPHP1 é frequentemente estudado em modelos de tubulogênese renal, dinâmica do transporte ciliar e relações genótipo–fenótipo na biologia das ciliopatias.

nephrocystin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NPHP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

nephrocystin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NPHP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NPHP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de nephrocystin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NPHP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de nephrocystin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via nephrocystin em células tumorais com expressão de NPHP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.