MyoD Plasmide KO CRISPR/Cas9 (h): sc-400092

Panoramica

MYOD1 codifica MyoD, un fattore di trascrizione basic helix–loop–helix (bHLH) che funge da regolatore maestro della miogenesi scheletrica legandosi ai motivi E-box e coordinando programmi trascrizionali specifici di linea. MyoD integra segnali provenienti da vie come Wnt, Notch e TGF-β/SMAD per controllare l’impegno dei mioblasti, l’uscita dal ciclo cellulare e la differenziazione, in cooperazione con cofattori tra cui MEF2 e complessi di modificazione della cromatina. Nelle cellule umane, l’attività di MYOD1 modella il rimodellamento epigenetico e l’adattamento metabolico durante lo sviluppo e la rigenerazione muscolare, rendendolo un nodo centrale negli studi sulla formazione del muscolo e sulla riprogrammazione cellulare. Una regolazione trascrizionale miogenica disfunzionale che coinvolge MYOD1 è stata collegata ad alterazioni degli stati di differenziazione ed è oggetto di studio nel contesto della fisiopatologia muscolare e di programmi di regolazione genica associati ai sarcomi.

MyoD Il plasmide CRISPR/Cas9 KO (h) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene MYOD1 in human linee cellulari. Ogni plasmide del pool co-esprime un sgRNA unico, mirato a un sito distinto all'interno del locus MYOD1, insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes, e codifica per la GFP per consentire l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo. Questa strategia multi-guida aumenta la probabilità di indurre spostamenti di lettura o delezioni che producono un knockout funzionale, offrendo un'alternativa più robusta agli approcci a guida singola. Le DSB indotte in più siti vengono risolte tramite giunzione non omologa (NHEJ) o, se utilizzate con il modello donatore HDR incluso, tramite riparazione diretta dall'omologia (HDR) in un sito bersaglio definito all'interno del locus.

Se utilizzato in combinazione con il donatore HDR che esprime RFP, la fluorescenza GFP e RFP può essere utilizzata insieme per distinguere le popolazioni cellulari trasfettate da quelle modificate, semplificando i flussi di lavoro di selezione e selezione dei cloni basati sulla citometria a flusso.

Donatore per riparazione diretta dall'omologia (HDR) — Cassetta puromicina con reporter RFP

Per applicazioni che richiedono cloni knockout confermati e selezionabili, il MyoD Plasmide HDR (h) include un costrutto donatore HDR contenente una cassetta di resistenza alla puromicina (PuroR) e un reporter proteina fluorescente rossa (RFP), affiancati da bracci di omologia specifici per un sito bersaglio definito MYOD1.
Se cotrasfettato con il MyoD Plasmide CRISPR/Cas9 KO (h):

• La cassetta PuroR-RFP si integra nel sito di taglio di Cas9 tramite HDR, interrompendo il frame di lettura aperto MYOD1.
  La fluorescenza RFP fornisce un indicatore visivo immediato dell'integrazione riuscita, consentendo l'identificazione o la selezione basata sulla fluorescenza delle cellule modificate prima o parallelamente alla selezione con puromicina.
  Le cellule modificate con successo vengono confermate attraverso la resistenza alla puromicina, riducendo sostanzialmente il carico di screening dei cloni.
  Questa strategia di selezione è ideale per generare linee cellulari KO clonali stabili per studi funzionali a valle, screening farmacologico o sviluppo di modelli.

Sistema di rimozione della cassetta Cre-lox

Il costrutto donatore HDR presenta siti loxP che fiancheggiano la cassetta di selezione PuroR-RFP per consentire la rimozione pulita del marcatore dopo la conferma del clone. L'espressione transiente della ricombinasi Cre tramite il vettore Cre incluso : sc-418923 elimina la cassetta, lasciando un sito loxP residuo minimo all'interno del locus MYOD1 ed eliminando potenziali effetti confondenti sui saggi a valle.
Questo approccio in due fasi:

• Riduce al minimo la perturbazione dell'architettura cromatinica locale e degli elementi regolatori adiacenti
  Ripristina un contesto genomico quasi nativo nel locus modificato
  Consente il riutilizzo della strategia di selezione con puromicina nella stessa linea cellulare per ulteriori modifiche

Caratteristiche principali

• gRNA mirato agli esoni MYOD1 critici per la funzione MyoD
  Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
  Donore HDR con resistenza alla puromicina per la selezione positiva dei cloni
  Cassetta PuroR fiancheggiata da loxP con vettore ricombinasi Cre per la rimozione senza soluzione di continuità del marcatore
  Fornito pronto all'uso per la somministrazione tramite trasfezione

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.