Munc13-4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404319-ACT

UNC13D codifica Munc13-4, un fattore di priming essenziale per l’esocitosi dei granuli citotossici regolata dal Ca²⁺ e di altri lisosomi secretori nelle cellule immunitarie. Munc13-4 coordina l’ancoraggio e la fusione delle vescicole regolando l’assemblaggio del complesso SNARE, supportando vie che controllano la degranulazione, il traffico di membrana e la secrezione regolata. Un’alterata funzione di UNC13D compromette l’attività citolitica delle cellule NK e dei linfociti T citotossici ed è associata a sindromi di disregolazione immunitaria caratterizzate da un difetto nel rilascio dei granuli. Di conseguenza, UNC13D viene spesso studiato nel contesto della funzione effettrice dei linfociti, dei checkpoint del trasporto vescicolare e della segnalazione infiammatoria legata a una secrezione difettosa.

Munc13-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UNC13D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Munc13-4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UNC13D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UNC13D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Munc13-4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UNC13D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Munc13-4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Munc13-4 nelle cellule tumorali con espressione di UNC13D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.