mucolipin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403931-ACT

MCOLN1 codifica la mucolipina 1 (TRPML1), un canale cationico endolisosomiale che regola il rilascio di Ca²⁺ necessario per il traffico di membrana, la biogenesi dei lisosomi e la fusione tra autofagosoma e lisosoma. TRPML1 si integra con reti di segnalazione lisosomiale che coinvolgono PI(3,5)P₂ e programmi trascrizionali dipendenti da TFEB/TFE3, i quali coordinano la clearance cellulare e il sensing dei nutrienti. L’alterazione della funzione di MCOLN1 compromette l’omeostasi endolisosomiale, portando all’accumulo di materiale di deposito anomalo e a dinamiche degli organelli modificate, caratteristiche delle malattie da accumulo lisosomiale. Di conseguenza, MCOLN1 è spesso studiato in vie che collegano la segnalazione del Ca²⁺ lisosomiale all’autofagia, all’infiammazione e alle risposte cellulari allo stress in modelli cellulari pertinenti.

mucolipin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MCOLN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

mucolipin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MCOLN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MCOLN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di mucolipin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MCOLN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da mucolipin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via mucolipin 1 nelle cellule tumorali con espressione di MCOLN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.