MLKL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401248-ACT

Humanes MLKL (mixed lineage kinase domain-like protein) ist ein zentraler Effektor der Nekroptose und wirkt nachgeschaltet der RIPK1/RIPK3-Signalübertragung, um einen entzündlichen, lytischen Zelltod auszulösen. Nach der Phosphorylierung durch RIPK3 wird MLKL konformationell aktiviert, oligomerisiert und transloziert zu zellulären Membranen, wo es die Membranintegrität stört und die Freisetzung von „damage-associated molecular patterns“ (DAMPs) fördert. Dieser Signalweg ist mit angeborenen Immunantworten und Zytokinsignalen verknüpft und steht in reguliertem Zelltod im Crosstalk mit Apoptose und Pyroptose, wodurch Gewebeentzündung und Wirtsabwehr mitgestaltet werden. Eine fehlregulierte MLKL-Aktivität und nekroptotische Signalgebung wurden in Modellen entzündlicher und neurodegenerativer Prozesse, ischämischer Schädigung sowie der Biologie des Tumormikromilieus in Verbindung gebracht, was MLKL zu einem hilfreichen Knotenpunkt für mechanistische Studien macht.

MLKL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen MLKL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MLKL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des MLKL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der MLKL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MLKL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native MLKL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MLKL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MLKL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem MLKL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.