Plasmide CRISPR d'Activation (h) MKLP-1: sc-400696-ACT

KIF23 code la protéine motrice de la famille des kinésines MKLP-1, un composant central du complexe centralspindlin qui coordonne l’assemblage du fuseau central et la formation du corps intermédiaire (midbody) lors de la cytocinèse. MKLP-1 intègre le transport dépendant des microtubules avec la signalisation RhoA afin de positionner le sillon de clivage et de réguler la dynamique de l’anneau contractile, contribuant ainsi à une ségrégation fidèle des chromosomes et à la progression du cycle cellulaire. Une activité dérégulée de KIF23/MKLP-1 est associée à des mitoses aberrantes, à l’aneuploïdie et à des états prolifératifs altérés, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la division des cellules tumorales, de l’instabilité génomique et du contrôle des points de contrôle du cycle cellulaire. Comme MKLP-1 agit à l’interface entre la mécanique du fuseau et le remodelage cortical, elle est fréquemment utilisée pour explorer les voies qui gouvernent la sortie de mitose et l’abscission cytocinétique.

MKLP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de KIF23 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

MKLP-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus KIF23 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription KIF23, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de MKLP-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus KIF23 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de MKLP-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie MKLP-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de KIF23 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.