Mfn1/Mitofusin 1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-426545-ACT

Il gene murino Mfn1 codifica la mitofusina 1, una GTPasi correlata alla dinamina localizzata sulla membrana mitocondriale esterna, che media l’ancoraggio e la fusione dei mitocondri per mantenere la connettività della rete e la capacità bioenergetica. MFN1 coopera con MFN2 durante la fusione della membrana esterna e si accoppia funzionalmente ai programmi di fusione della membrana interna e di organizzazione delle creste, a supporto della fosforilazione ossidativa, dell’omeostasi del calcio e della stabilità del DNA mitocondriale. Modellando la morfologia mitocondriale, MFN1 influenza la mitofagia e la segnalazione apoptotica, collegando il controllo qualità dei mitocondri alle risposte cellulari allo stress. Un’alterata regolazione dell’equilibrio fusione–fissione mitocondriale che coinvolge MFN1 è rilevante negli studi su neurodegenerazione, stress cardiometabolico e fenotipi dello sviluppo, in cui la dinamica mitocondriale influisce sull’omeostasi tissutale.

Mfn1/Mitofusin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Mfn1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Mfn1/Mitofusin 1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Mfn1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Mfn1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Mfn1/Mitofusin 1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Mfn1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Mfn1/Mitofusin 1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Mfn1/Mitofusin 1 nelle cellule tumorali con espressione di Mfn1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.