Met Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400101-ACT

MET codifica o receptor tirosina-quinase humano Met, o principal receptor de sinalização do fator de crescimento de hepatócitos (HGF). A ativação de Met dependente de ligante desencadeia a autofosforilação e propaga cascatas a jusante, incluindo PI3K–AKT, RAS–MAPK, STAT e SRC/FAK, coordenando programas de proliferação, sobrevivência, motilidade e transição epitélio–mesênquima. A desregulação da via de MET por superexpressão, amplificação, mutações ativadoras ou sinalização autócrina aberrante é frequentemente estudada em oncologia e biologia do desenvolvimento devido ao seu papel no crescimento invasivo, na competência metastática e nas respostas de regeneração tecidual.

Met O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MET sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Met O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MET em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MET, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Met. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MET nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Met no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Met em células tumorais com expressão de MET silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.