Mel-18 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401776-ACT

O PCGF2 codifica a Mel-18, uma proteína do grupo Polycomb com domínio RING finger que atua no complexo repressor Polycomb canónico 1 (PRC1) para estabelecer e manter programas de repressão transcricional. Por meio da compactação da cromatina mediada pelo PRC1 e da cooperação com a trimetilação de H3K27 dependente do PRC2, a Mel-18 contribui para o controlo epigenético da especificação de linhagens, da autorrenovação de células estaminais e da regulação do ciclo celular. O PCGF2 tem sido associado à regulação da expressão de genes HOX e de outros loci do desenvolvimento, e a atividade Polycomb alterada está frequentemente ligada a estados aberrantes de proliferação e diferenciação no cancro e noutras doenças. Como a Mel-18 modula a acessibilidade da cromatina e a memória transcricional, o PCGF2 é amplamente estudado em dinâmica do epigenoma, reprogramação oncogénica e modelos de biologia do desenvolvimento.

Mel-18 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PCGF2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Mel-18 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PCGF2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PCGF2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Mel-18. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PCGF2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Mel-18 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Mel-18 em células tumorais com expressão de PCGF2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.