MEK kinase-3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404290-ACT

Il gene umano MAP3K3 codifica per la MEK chinasi-3 (MAP3K3), una MAP chinasi chinasi chinasi a serina/treonina che integra segnali a monte provenienti da recettori per citochine, recettori Toll-like e stress cellulare, propagando la trasduzione del segnale attraverso le cascate MAPK. MAP3K3 contribuisce alla regolazione di NF-κB e di programmi trascrizionali guidati dalle MAPK che influenzano infiammazione, sopravvivenza cellulare, differenziamento e dinamica del citoscheletro. Attraverso queste reti, MAP3K3 modula le risposte delle cellule endoteliali e immunitarie, includendo vie collegate alla segnalazione angiogenica e all’attivazione dell’immunità innata. Un’attività di MAP3K3 deregolata e un’alterazione dell’architettura delle vie di segnalazione sono state associate a stati infiammatori e a contesti di segnalazione oncogenica, a supporto della sua utilità come nodo per studi meccanicistici dei pathway.

MEK kinase-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MAP3K3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MEK kinase-3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MAP3K3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MAP3K3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MEK kinase-3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MAP3K3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MEK kinase-3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MEK kinase-3 nelle cellule tumorali con espressione di MAP3K3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.