megalin/LRP2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401094-ACT

LRP2 codifica per la megalina, un recettore endocitico multiligando della famiglia dei recettori LDL, altamente espresso negli epiteli assorbenti e in grado di mediare l’internalizzazione, dipendente dalla clatrina, di diversi ligandi proteici, vitamine e complessi ormone–proteina trasportatrice. Megalina/LRP2 coordina la captazione mediata da recettore e il traffico verso endosomi e lisosomi, contribuendo alla polarità epiteliale, all’omeostasi dei nutrienti e alla rimozione delle proteine extracellulari; inoltre interagisce funzionalmente con vie che coinvolgono cubilina/AMN, la gestione dell’albumina e della proteina legante la vitamina D, e ligandi associati alle lipoproteine. Nel sistema nervoso e in altri tessuti, LRP2 è stata collegata alla regolazione della segnalazione dei morfogeni, inclusa la modulazione della disponibilità di Sonic hedgehog e BMP durante lo sviluppo. L’alterazione genetica o funzionale di LRP2 è associata a fenotipi sindromici dello sviluppo e a difetti di riassorbimento delle proteine a livello dei tubuli renali, rendendola rilevante per studi sul trasporto epiteliale, la segnalazione dello sviluppo e il traffico recettoriale.

megalin/LRP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LRP2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

megalin/LRP2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LRP2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LRP2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di megalin/LRP2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LRP2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da megalin/LRP2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via megalin/LRP2 nelle cellule tumorali con espressione di LRP2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.