MAN1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404258-ACT

Humanes **LEMD3** kodiert das Protein **MAN1** der inneren Kernmembran, einen LEM-Domänen-Faktor, der die Kernarchitektur mit der Transkriptionskontrolle verknüpft. MAN1 bindet rezeptorregulierte SMADs und moduliert den Output der TGF-β/BMP-Signalübertragung; dadurch beeinflusst es Programme, die die Regulation der extrazellulären Matrix, die Differenzierung und die Gewebehomöostase steuern. Über Interaktionen mit Laminen und chromatinassoziierten Komplexen trägt MAN1 zur Organisation der Kernhülle und zur mechanosensitiven Genregulation bei. Eine Fehlregulation der LEMD3/MAN1-Aktivität wurde mit Bindegewebs- und Skelettphänotypen in Verbindung gebracht und wird in Kontexten untersucht, in denen veränderte SMAD-abhängige Transkription und Kernhüllenfunktion zusammenlaufen.

MAN1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LEMD3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

MAN1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LEMD3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LEMD3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen MAN1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LEMD3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von MAN1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des MAN1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LEMD3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.