MAK Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421549-ACT

O gene Mak de camundongo codifica a quinase associada às células germinativas masculinas (MAK), uma quinase de serina/treonina que contribui para o controle do ciclo celular e para programas de diferenciação, com papéis proeminentes na biologia relacionada aos cílios. A atividade de MAK tem sido associada à regulação da progressão mitótica e a redes de sinalização dependentes de fosforilação que influenciam a organização dos microtúbulos e a função do centrossomo. Em células diferenciadas, a MAK está implicada na regulação do comprimento do cílio primário e no tráfego ciliar, processos que moldam vias de transdução de sinal como a Hedgehog. A desregulação de vias associadas à MAK tem sido estudada no contexto de fenótipos proliferativos e de defeitos de desenvolvimento e de homeostase tecidual dependentes de cílios, sustentando sua relevância para a modelagem mecanística de doenças.

MAK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Mak sem alterar a sequência de ADN subjacente.

MAK O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Mak em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Mak, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de MAK. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Mak nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de MAK no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via MAK em células tumorais com expressão de Mak silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.