Plasmide CRISPR d'Activation (h) mAChR M5: sc-402943-ACT

CHRM5 code le récepteur muscarinique humain de l’acétylcholine M5 (mAChR M5), un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) qui se couple préférentiellement à Gq/11 pour stimuler la signalisation de la phospholipase C, la production de phosphates d’inositol, la mobilisation du Ca2+ intracellulaire et l’activation de la protéine kinase C. Par ces voies, le mAChR M5 module l’excitabilité neuronale et la transmission synaptique, avec des rôles supplémentaires dans le tonus vasculaire et les processus sécrétoires selon le contexte cellulaire. La signalisation régulée par CHRM5 recoupe les réseaux MAPK/ERK et d’autres réseaux de seconds messagers qui façonnent l’expression génique et les réponses cellulaires adaptatives. Une signalisation cholinergique des RCPG dérégulée a été associée à des phénotypes neuropsychiatriques et neurodégénératifs, ainsi qu’à des processus cardiométaboliques et inflammatoires, faisant de CHRM5 un nœud pertinent pour des études mécanistiques du couplage des voies et des programmes transcriptionnels induits par les récepteurs.

mAChR M5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHRM5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

mAChR M5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHRM5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHRM5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de mAChR M5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHRM5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de mAChR M5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie mAChR M5 dans les cellules tumorales présentant une expression de CHRM5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.