MACF1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402923-ACT

MACF1 (fattore 1 di collegamento microtubuli–actina) è una grande spectraplakina del citoscheletro che coordina le interazioni tra microtubuli e actina per controllare la polarità cellulare, il traffico intracellulare e la migrazione direzionale. Organizzando la dinamica delle estremità “plus” dei microtubuli alla corteccia cellulare e collegando le reti citoscheletriche, MACF1 contribuisce a processi come la crescita dei neuriti, l’organizzazione epiteliale e la motilità associata alle ferite. Studi funzionali collocano MACF1 in vie che integrano la segnalazione Wnt/β-catenina con il rimodellamento del citoscheletro e la dinamica delle adesioni, influenzando la morfogenesi dei tessuti e la meccanotrasduzione. La deregolazione o la variabilità genetica di MACF1 è stata associata a fenotipi neuroevolutivi e neuropsichiatrici ed è stata studiata anche in contesti in cui un’organizzazione citoscheletrica alterata sostiene comportamenti cellulari invasivi.

MACF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MACF1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MACF1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MACF1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MACF1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MACF1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MACF1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MACF1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MACF1 nelle cellule tumorali con espressione di MACF1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.