Plásmido CRISPR de Activación (m) LRRK2: sc-426167-ACT

La quinasa 2 con repeticiones ricas en leucina (LRRK2) es una gran proteína multidominio con actividad de quinasa serina/treonina y de GTPasa que coordina el tráfico vesicular, la homeostasis endolisosomal, la dinámica del citoesqueleto y la autofagia mediante interacciones con GTPasas Rab y redes de señalización asociadas. En células de ratón, la actividad de Lrrk2 influye en la remodelación dependiente de fosforilación de las vías de tráfico de membranas, vinculando las respuestas inmunitarias innatas y el control de calidad mitocondrial con la adaptación celular al estrés. La desregulación de la señalización de LRRK2 se ha estudiado ampliamente en mecanismos asociados a la neurodegeneración, incluidos cambios en la proteostasis, deterioro de la función lisosomal y señalización inflamatoria aberrante. Estas características hacen de Lrrk2 un nodo útil para analizar la comunicación cruzada entre vías de mantenimiento neuronal, activación glial y transporte intracelular.

LRRK2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Lrrk2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

LRRK2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Lrrk2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Lrrk2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de LRRK2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Lrrk2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de LRRK2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía LRRK2 en células tumorales con expresión de Lrrk2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.