Plasmide CRISPR d'Activation (h) LRRK2: sc-402602-ACT

La leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) est une kinase sérine/thréonine et une GTPase multidomaine qui intègre des signaux au niveau de compartiments membranaires afin de coordonner le trafic vésiculaire, la dynamique endolysosomale, l’organisation du cytosquelette et l’autophagie. LRRK2 phosphoryle plusieurs GTPases Rab et interagit avec des processus associés aux microtubules et à l’actine, reliant l’activité kinase au transport des organites et aux voies de protéostasie. Dans les cellules humaines, une signalisation LRRK2 dérégulée est largement associée à la vulnérabilité neuronale et aux réponses au stress liées à l’immunité, ce qui en fait un nœud central pour les études mécanistiques de la biologie pertinente pour la maladie de Parkinson. La modulation expérimentale de l’expression de LRRK2 est utilisée pour étudier le dialogue entre voies impliquant la fonction lysosomale, l’homéostasie mitochondriale et les cascades de signalisation inflammatoire.

LRRK2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de LRRK2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

LRRK2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus LRRK2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription LRRK2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de LRRK2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus LRRK2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de LRRK2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie LRRK2 dans les cellules tumorales présentant une expression de LRRK2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.