LGR4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402643-ACT

LGR4 umano (leucine-rich repeat–containing G protein-coupled receptor 4) è un recettore di membrana che funge da modulatore chiave della segnalazione Wnt/β-catenina potenziata da R-spondin, influenzando la stabilità del complesso recettoriale sulla superficie cellulare. Attraverso questo asse, LGR4 contribuisce a regolare la proliferazione e la differenziazione cellulari e l’omeostasi tissutale, con effetti a valle sul comportamento delle cellule staminali/progenitrici e sul rimodellamento epiteliale. L’attività di LGR4 si interseca con vie che controllano le decisioni di destino cellulare e la patterning guidata da morfogeni, rendendolo rilevante per studi di biologia dello sviluppo e dei processi rigenerativi. Alterazioni degli input della via Wnt che coinvolgono LGR4 sono state associate a un controllo della crescita e a una specificazione di linea alterati in contesti patologici.

LGR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LGR4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LGR4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LGR4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LGR4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LGR4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LGR4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LGR4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LGR4 nelle cellule tumorali con espressione di LGR4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.