Plásmido CRISPR de Activación (h) KCC4: sc-405528-ACT

SLC12A7 codifica el KCC4 humano (cotransportador K–Cl 4), un transportador electroneutro que acopla el eflujo de K+ y Cl− para regular el cloruro intracelular, la homeostasis del volumen celular y la excitabilidad de la membrana. La actividad de KCC4 contribuye al transporte iónico epitelial y a procesos relacionados con el pH, moldeando el equilibrio osmótico y la señalización dependiente de cloruro en diversos tejidos. Mediante la modulación de los gradientes de Cl−, KCC4 puede influir en la inhibición neuronal y en la dinámica del citoesqueleto vinculada a fenotipos de migración e invasión. Se han descrito alteraciones en la expresión de SLC12A7/KCC4 en múltiples contextos patológicos, lo que respalda su estudio en mecanismos de transporte iónico desregulado, respuestas al estrés celular y remodelación tisular.

KCC4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SLC12A7 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

KCC4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SLC12A7 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SLC12A7, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de KCC4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SLC12A7 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de KCC4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía KCC4 en células tumorales con expresión de SLC12A7 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.