karyopherin α6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403459-ACT

KPNA6 codifica la carioferina alfa 6, un adattatore della famiglia delle importine-α che riconosce i classici segnali di localizzazione nucleare e collega le proteine cargo all’importina-β per il trasporto attraverso il complesso del poro nucleare. Regolando il traffico nucleo-citoplasmatico di fattori di trascrizione, proteine di riparazione del DNA e regolatori del ciclo cellulare, KPNA6 contribuisce al controllo dei programmi di espressione genica e della proteostasi. Alterazioni nelle dinamiche di importazione nucleare sono implicate in proliferazione deregolata, risposte allo stress e stabilità genomica, collegando il trasporto dipendente da KPNA6 a meccanismi rilevanti nella biologia del cancro e in altri disturbi in cui la segnalazione nucleare è perturbata. KPNA6 è quindi un nodo utile per studiare la regolazione della trascrizione e delle vie di segnalazione dipendente dalla compartimentalizzazione.

karyopherin α6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KPNA6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

karyopherin α6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KPNA6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KPNA6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di karyopherin α6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KPNA6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da karyopherin α6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via karyopherin α6 nelle cellule tumorali con espressione di KPNA6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.