ISG15 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400996-ACT

ISG15 umano codifica un modificatore ubiquitina-simile indotto dagli interferoni, che viene coniugato a proteine cellulari e virali attraverso la cascata di ISGilazione, modellando la segnalazione dell’immunità innata e la proteostasi. ISG15 regola le risposte all’interferone di tipo I modulando vie come la segnalazione JAK–STAT e influenzando l’attività e la stabilità di effettori antivirali chiave, con ulteriori funzioni come fattore immunomodulatore secreto. Attraverso questi meccanismi, ISG15 incide sulle risposte cellulari all’infezione virale, agli stimoli infiammatori e allo stress, e la sua disregolazione è stata collegata a fenotipi di segnalazione dell’interferone aberranti e a meccanismi patogenetici di malattie immuno-correlate. Nella ricerca oncologica e sulle malattie infettive, ISG15 è spesso studiato come mediatore dipendente dal contesto di evasione immunitaria, infiammazione e programmi trascrizionali guidati dall’interferone.

ISG15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ISG15 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ISG15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ISG15 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ISG15, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ISG15. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ISG15 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ISG15 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ISG15 nelle cellule tumorali con espressione di ISG15 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.