IRE1α Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-400576-LAC

ERN1 codifica l’enzima 1 alfa richiedente inositolo (IRE1α), una chinasi/endoribonucleasi transmembrana residente nel reticolo endoplasmatico (RE) che funge da sensore primario delle proteine mal ripiegate e da iniziatore chiave della risposta alle proteine non correttamente ripiegate (UPR). In condizioni di stress del RE, IRE1α oligomerizza e si autofosforila, attivando funzioni RNasiche che includono lo splicing non convenzionale dell’mRNA di XBP1 per generare il fattore di trascrizione XBP1s e la degradazione regolata dipendente da IRE1 (RIDD) di specifici trascritti, al fine di rimodellare la capacità secretoria. Queste attività si integrano con la proteostasi, il metabolismo lipidico, l’autofagia e la segnalazione infiammatoria tramite il crosstalk dell’UPR con vie quali NF-κB e JNK. Una segnalazione ERN1/IRE1α deregolata è associata all’adattamento allo stress cellulare nel cancro, in contesti di malattie metaboliche, nella neurodegenerazione e nella differenziazione delle cellule immunitarie, rendendola un nodo ampiamente utilizzato per studi meccanicistici della segnalazione dello stress del RE.

Le particelle di attivazione lentivirale IRE1α (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di ERN1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale IRE1α (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione ERN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di IRE1α. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo ERN1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.