Plásmido CRISPR de Activación (h) IFT88: sc-404089-ACT

El IFT88 humano codifica un componente central del complejo B de transporte intraflagelar (IFT), necesario para el ensamblaje y mantenimiento del cilio primario, así como para el transporte anterógrado a lo largo de los microtúbulos axonemales. Al permitir la importación y el recambio de proteínas ciliares, IFT88 sostiene vías clave de señalización sensorial y del desarrollo coordinadas en el cilio, incluidas Hedgehog y otras cascadas mediadas por receptores que influyen en el control del ciclo celular y la diferenciación. La alteración de la ciliogénesis dependiente de IFT88 perturba la dinámica de la señalización ciliar y la polaridad celular, procesos ampliamente implicados en las ciliopatías y otros trastornos relacionados que afectan la morfogénesis y la homeostasis tisular. Como nodo central de la biología del cilio, IFT88 se estudia con frecuencia para vincular defectos de tráfico con desregulación de vías y fenotipos como proliferación, migración u organización epitelial alteradas.

IFT88 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de IFT88 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

IFT88 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus IFT88 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional IFT88, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de IFT88. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo IFT88 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de IFT88 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía IFT88 en células tumorales con expresión de IFT88 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.