IFT172 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404379-ACT

IFT172 codifica una componente del complesso B del trasporto intraflagellare (IFT), essenziale per il traffico anterogrado all’interno delle ciglia primarie, sostenendo l’assemblaggio dell’assonema, la manutenzione ciliare e la trasduzione del segnale. Consentendo il movimento del carico ciliare, IFT172 influenza vie di sviluppo e di omeostasi dipendenti dalle ciglia, inclusa la segnalazione Hedgehog e altri processi mediati da recettori che richiedono un’architettura ciliare integra. L’alterazione o la disregolazione di IFT172 è associata a fenotipi riconducibili alle ciliopatie, collegando un trasporto ciliare compromesso a difetti nella patterning tissutale, nella funzione sensoriale e nello sviluppo degli organi. In quanto fattore di trasporto ciliare, IFT172 è ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi della ciliogenesi, le dinamiche della segnalazione mediata dalle ciglia e le relazioni genotipo–fenotipo in modelli cellulari umani.

IFT172 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IFT172 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IFT172 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IFT172 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IFT172, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IFT172. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IFT172 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IFT172 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IFT172 nelle cellule tumorali con espressione di IFT172 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.