HSPC171 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-412030-ACT

TMEM208 codifica a proteína de membrana humana HSPC171, um fator associado ao retículo endoplasmático (RE) implicado na manutenção da homeostase do RE e na coordenação de respostas adaptativas ao stress proteostático e metabólico. Ao influenciar a organização do RE e as saídas de sinalização ligadas às vias da resposta a proteínas mal dobradas (UPR), o TMEM208 pode afetar processos a jusante como o controlo de qualidade proteica, o metabolismo/gestão de lípidos e programas transcricionais induzidos por stress. A sinalização alterada de stress do RE e o desequilíbrio da proteostase são características recorrentes no cancro, na neurodegeneração e em perturbações metabólicas, o que torna o TMEM208/HSPC171 relevante para estudos mecanísticos que ligam a função do RE à sobrevivência celular, diferenciação e sinalização inflamatória. Como componente transmembranar com potenciais funções reguladoras, o TMEM208 também é de interesse para mapear redes residentes em organelos e identificar dependências específicas do contexto entre diferentes tipos celulares.

HSPC171 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TMEM208 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

HSPC171 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TMEM208 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TMEM208, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de HSPC171. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TMEM208 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de HSPC171 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via HSPC171 em células tumorais com expressão de TMEM208 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.