HSPA6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400870-ACT

HSPA6 codifica un membro della famiglia HSP70 inducibile dallo stress che funge da chaperone molecolare ATP-dipendente per stabilizzare proteine nascenti o danneggiate, promuoverne il ripiegamento e prevenire l’aggregazione durante lo stress proteotossico. Viene rapidamente sovraregolato da shock termico e altri insulti cellulari tramite programmi trascrizionali mediati dai fattori dello shock termico e partecipa a reti di proteostasi che si intrecciano con la risposta alle proteine mal ripiegate (unfolded protein response), il turnover ubiquitina–proteasoma e l’autofagia. Poiché modula la capacità di controllo qualità delle proteine, le variazioni di espressione di HSPA6 sono spesso esaminate in contesti di stress ossidativo, infiammazione e danno cellulare. Un’attività chaperonica disregolata e una proteostasi compromessa sono ampiamente rilevanti per la neurodegenerazione, l’adattamento allo stress delle cellule tumorali e i modelli di danno tissutale, rendendo HSPA6 un utile indicatore e modulatore negli studi di biologia dello stress.

HSPA6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HSPA6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HSPA6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HSPA6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HSPA6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HSPA6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HSPA6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HSPA6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HSPA6 nelle cellule tumorali con espressione di HSPA6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.