HSPA5/BiP/GRP78 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-400073-LAC

HSPA5 codifica per BiP/GRP78, uno chaperone della famiglia HSP70 del reticolo endoplasmatico (RE) che si lega ai polipeptidi nascenti e regola il controllo di qualità del ripiegamento proteico. In quanto sensore centrale dell’omeostasi del RE, HSPA5 modula la risposta alle proteine mal ripiegate (UPR) attraverso interazioni che influenzano la segnalazione di PERK, IRE1 e ATF6, collegando la proteostasi alla degradazione associata al RE, alla gestione del calcio e alle risposte allo stress ossidativo. Un’attività di HSPA5 deregolata è comunemente studiata in contesti di stress cronico del RE, tra cui l’adattamento delle cellule tumorali, le malattie metaboliche e la neurodegenerazione, in cui alterazioni della proteostasi e della segnalazione UPR contribuiscono alla sopravvivenza cellulare e alle vie infiammatorie. Poiché BiP/GRP78 influisce sulla secrezione e sulla maturazione delle proteine di membrana, è rilevante anche per studi sul processamento delle proteine virali e sulle interazioni ospite–patogeno.

Le particelle di attivazione lentivirale HSPA5/BiP/GRP78 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di HSPA5 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale HSPA5/BiP/GRP78 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione HSPA5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di HSPA5/BiP/GRP78. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo HSPA5 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.