HMG-1/HMGB1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420871-ACT

Hmgb1 codifica HMG-1/HMGB1, un’abbondante proteina della cromatina non istonica che si lega al DNA e lo piega per regolare la dinamica dei nucleosomi, la trascrizione, la replicazione e la riparazione del DNA. Nel nucleo, HMGB1 sostiene la stabilità del genoma partecipando alle risposte al danno del DNA e influenza programmi di espressione genica legati alle decisioni sul destino cellulare. Quando viene rilasciata nello spazio extracellulare, HMGB1 funge da pattern molecolare associato al danno (DAMP) che modula la segnalazione dell’immunità innata e le vie infiammatorie, incluse risposte mediate da recettori che coinvolgono TLR e RAGE. L’attività disregolata di HMGB1 è ampiamente studiata in contesti quali l’infiammazione sterile, l’autoimmunità, la neuroinfiammazione, modelli biologici di sepsi e l’infiammazione associata ai tumori nei sistemi murini.

HMG-1/HMGB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hmgb1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HMG-1/HMGB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hmgb1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hmgb1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HMG-1/HMGB1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hmgb1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HMG-1/HMGB1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HMG-1/HMGB1 nelle cellule tumorali con espressione di Hmgb1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.