Plasmide CRISPR d'Activation (m) hippocalcin: sc-420938-ACT

Hpca code l’hippocalcine, une protéine de liaison au calcium de type EF-hand enrichie dans les neurones, qui agit comme capteur de calcium reliant les transitoires de Ca2+ dépendants de l’activité à la signalisation en aval. L’hippocalcine participe aux mécanismes de plasticité synaptique en modulant des interactions protéiques régulées par le Ca2+, l’association membranaire via un « commutateur » myristoylé, ainsi que des processus liés à l’endocytose qui façonnent la neurotransmission. Dans les circuits cérébraux de la souris, l’expression de Hpca est associée à la régulation de l’excitabilité neuronale et à des modifications synaptiques à long terme, ce qui la relie à des voies influençant l’apprentissage et la mémoire. Des altérations de l’homéostasie du calcium et de la signalisation synaptique impliquent des réseaux liés à l’hippocalcine dans des phénotypes pertinents pour la neurodégénérescence et les troubles neuropsychiatriques, utilisés dans des modèles de recherche mécanistique.

hippocalcin Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Hpca sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

hippocalcin Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Hpca dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Hpca, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de hippocalcin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Hpca natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de hippocalcin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie hippocalcin dans les cellules tumorales présentant une expression de Hpca silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.