Hemoglobin ε Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403392-ACT

HBE1 codifica la catena epsilon dell’emoglobina embrionale, una subunità globinica che si associa a catene di tipo alfa per formare emoglobina funzionale nelle prime fasi dello sviluppo umano. L’emoglobina ε contribuisce al trasporto dell’ossigeno e all’equilibrio redox nelle cellule eritroidi, collegando la sua espressione alla biosintesi dell’eme, alla gestione del ferro e ai programmi di differenziazione eritroide regolati dalla regione di controllo del locus delle globine. Il passaggio (“switching”) dallo stato embrionale a quello fetale e poi adulto dell’espressione delle globine è un processo trascrizionale finemente regolato che coinvolge rimodellamento della cromatina e fattori trascrizionali specifici di linea cellulare. La disregolazione della regolazione dei geni delle globine e dell’assemblaggio dell’emoglobina è rilevante per le emoglobinopatie e, più in generale, per gli studi su eritropoiesi, stress ossidativo e biologia responsiva all’ipossia.

Hemoglobin ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HBE1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Hemoglobin ε Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HBE1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HBE1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Hemoglobin ε. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HBE1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Hemoglobin ε nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Hemoglobin ε nelle cellule tumorali con espressione di HBE1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.