HAI-1 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-423128-LAC

Mouse Spint1 codifica l’inibitore dell’attivatore del fattore di crescita degli epatociti-1 (HAI-1), un inibitore di proteasi seriniche di tipo Kunitz ancorato alla membrana che limita la proteolisi pericellulare sulle superfici epiteliali. HAI-1 regola l’attivazione e l’attività di proteasi quali matriptasi (ST14) e HGFA, contribuendo così a modellare il rimodellamento della matrice extracellulare, la maturazione dei fattori di crescita e l’omeostasi della barriera epiteliale. Attraverso queste reti di proteasi, Spint1 influenza processi quali adesione cellulare, polarità e migrazione, ed è strettamente collegato a contesti di segnalazione come le vie dipendenti da HGF/c-MET. Uno squilibrio nella regolazione di Spint1/HAI-1 è stato associato a un rimodellamento epiteliale aberrante e a fenotipi infiammatori o neoplastici, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sull’integrità epiteliale e sulla segnalazione guidata dalle proteasi.

Le particelle di attivazione lentivirale HAI-1 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Spint1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale HAI-1 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Spint1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di HAI-1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Spint1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.