G_{β 4} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400820-ACT

GNB4 codifica la subunità beta 4 (Gβ4) della proteina G eterotrimerica umana, un’impalcatura centrale che stabilizza le subunità Gα e Gγ e propaga i segnali a valle dei GPCR attivati. Coordinando l’interazione con gli effettori, Gβ4 contribuisce a modulare vie di secondo messaggero come la segnalazione cAMP/PKA e PLCβ–IP3/DAG–Ca²⁺, influenzando anche cascate chinasi tra cui MAPK/ERK. Questi processi regolano esiti dipendenti dal contesto quali proliferazione, differenziazione, secrezione ed eccitabilità neuronale. Alterazioni nella dinamica della segnalazione GPCR–proteine G che coinvolgono GNB4 sono state studiate in relazione a fenotipi neurologici e a una più ampia disregolazione della segnalazione rilevante per stati cellulari associati a patologie.

Gβ 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNB4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gβ 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNB4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNB4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gβ 4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNB4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gβ 4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gβ 4 nelle cellule tumorali con espressione di GNB4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.