G_{β 2} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402936-ACT

GNB2 codifica la subunità beta 2 (Gβ2) della proteina G umana, un componente fondamentale delle proteine G eterotrimeriche che collegano i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) attivati agli effettori intracellulari. In associazione con le subunità Gγ, Gβ2 contribuisce a regolare output di segnalazione quali l’attività dell’adenilato ciclasi, l’attivazione della fosfolipasi Cβ, la modulazione dei canali ionici e le vie a valle associate a MAPK e PI3K, che influenzano proliferazione e migrazione cellulare, oltre alla neurotrasmissione. Alterazioni della segnalazione GPCR/proteine G che coinvolgono GNB2 sono state associate a una trasduzione del segnale deregolata in contesti neurologici e oncogenici, rendendolo rilevante per studi meccanicistici delle reti di segnalazione prossimali al recettore. In quanto scaffold di segnalazione ampiamente espresso, Gβ2 è spesso utilizzato per indagare il crosstalk tra vie e i programmi trascrizionali dipendenti dallo stimolo.

Gβ 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gβ 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gβ 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gβ 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gβ 2 nelle cellule tumorali con espressione di GNB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.