G_{β 1} Particelle di Attivazione Lentivirale (m2): sc-420606-LAC-2

Il gene murino Gnb1 codifica la subunità Gβ1 della proteina G eterotrimerica, un componente fondamentale della segnalazione mediata da GPCR che forma dimeri obbligati con le subunità Gγ per regolare l’attività di Gα e trasmettere segnali verso effettori quali le adenilil ciclasi, la fosfolipasi Cβ e i canali ionici. Attraverso queste interazioni, Gβ1 contribuisce a coordinare la dinamica dei secondi messaggeri, l’eccitabilità di membrana e cascate chinasi, inclusa la via MAPK/ERK, modulando le risposte cellulari a neurotrasmettitori, ormoni e stimoli sensoriali. Alterazioni della segnalazione dipendente da Gβ1 sono rilevanti negli studi su disfunzioni del neurosviluppo e della neurofisiologia, in cui perturbazioni dell’equilibrio delle vie GPCR possono influenzare la trasmissione sinaptica e l’attività di rete. L’editing o la perturbazione del gene Gnb1 in modelli murini consente l’analisi meccanicistica dell’accoppiamento GPCR-effettore, del bias di segnale e del cross-talk tra vie, mediante saggi come letture di cAMP/PLC, elettrofisiologia e profilazione fosfoproteomica.

Le particelle di attivazione lentivirale Gβ 1 (m2) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Gnb1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale Gβ 1 (m2) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Gnb1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di Gβ 1. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Gnb1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.