GRK 6 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402061-ACT

La GRK6 umana (G protein-coupled receptor kinase 6) è una chinasi serina/treonina che fosforila i GPCR attivati per favorire il reclutamento di β-arrestina, la desensibilizzazione del recettore e il traffico endocitico. Modulando la dinamica della segnalazione dei GPCR, GRK6 influenza le cascate a valle di secondi messaggeri e chinasi, incluse cAMP/PKA e MAPK/ERK, con effetti sulla migrazione cellulare, sulla segnalazione infiammatoria e sulle risposte neuronali. GRK6 è stata studiata nel contesto della regolazione dei recettori delle chemochine e del traffico delle cellule immunitarie, con associazioni rilevanti per la malattia riportate in processi neuroinfiammatori, nella disregolazione della segnalazione cardiovascolare e nel rimodellamento delle vie GPCR associato al cancro. Il suo livello di espressione endogena e l’attività dipendente dal contesto rendono GRK6 un nodo utile per indagare il bias recettoriale, l’ampiezza del segnale e i feedback adattativi nelle reti GPCR.

GRK 6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GRK6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRK 6 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GRK6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GRK6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRK 6. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GRK6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRK 6 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRK 6 nelle cellule tumorali con espressione di GRK6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.