Grim19 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403264-ACT

NDUFA13 umano codifica Grim19, una subunità accessoria del complesso I della catena respiratoria mitocondriale che supporta il trasferimento di elettroni e la fosforilazione ossidativa, contribuendo a mantenere il potenziale di membrana mitocondriale e la produzione cellulare di ATP. Oltre alla bioenergetica, Grim19 è stato associato all’omeostasi redox e alla segnalazione di stress mitocondriale, collegando la funzione mitocondriale a una regolazione più ampia dell’apoptosi e delle reti di segnalazione infiammatoria. Un’alterata espressione di NDUFA13 o la disfunzione del complesso I è associata a meccanismi di malattie mitocondriali ed è stata studiata in contesti di disregolazione metabolica, neurodegenerazione e biologia tumorale, dove respirazione, ROS e vie di sopravvivenza cellulare si intersecano.

Grim19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NDUFA13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Grim19 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NDUFA13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NDUFA13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Grim19. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NDUFA13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Grim19 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Grim19 nelle cellule tumorali con espressione di NDUFA13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.