GRASP65 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402436-ACT

Das humane Gen **GORASP1** kodiert **GRASP65**, ein peripheres Membranprotein, das am **cis-Golgi** lokalisiert ist und als zentraler Organisator der Architektur des Golgi-Bandes (Golgi-Ribbon) fungiert. GRASP65 trägt zur Stapelung der Golgi-Zisternen, zum Tethering von Vesikeln sowie zur Reassemblierung der Golgi-Membranen beim Eintritt in die Mitose und beim Austritt daraus bei und ist dabei in den ER-zu-Golgi-Transport sowie die übergeordnete Kontrolle des sekretorischen Weges eingebunden. Durch seine Rollen in der Organisation von Organellen und der Prozessierung von Fracht beeinflusst GRASP65 die Proteinsortierung, Glykosylierung und den polarisierten Transport, die für Zellzyklusprogression und Stressantworten von zentraler Bedeutung sind. Eine Fehlregulation der Golgi-Struktur und von Trafficking-Pathways unter Beteiligung von GRASP65 ist für krankheitsassoziierte Phänotypen in der Krebsbiologie und bei Neurodegeneration relevant, wo veränderte Sekretion und Organell-Remodelling häufig beobachtet werden.

GRASP65 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GORASP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GRASP65 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GORASP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GORASP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GRASP65-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GORASP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GRASP65-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GRASP65-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GORASP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.