GPR171 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-412047-ACT

GPR171 codifica un recettore orfano accoppiato a proteine G di classe A, arricchito nel sistema nervoso centrale e implicato nella segnalazione neuromodulatoria. In quanto GPCR, ci si aspetta che si accoppi a proteine G eterotrimeriche per influenzare vie di secondi messaggeri come la segnalazione cAMP/PKA e MAPK, modellando così l’eccitabilità neuronale e la trasmissione sinaptica. Associazioni riportate collegano un’alterazione della segnalazione di GPR171 a fenotipi neurocomportamentali e a vie rilevanti per i processi di ricompensa, la risposta allo stress e il comportamento alimentare. Queste caratteristiche rendono GPR171 un bersaglio utile per studiare la regolazione dei GPCR, il traffico recettoriale e i programmi trascrizionali a valle in contesti neuronali e neuroendocrini.

GPR171 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR171 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR171 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR171 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR171, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR171. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR171 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR171 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR171 nelle cellule tumorali con espressione di GPR171 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.