GP78 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402346-ACT

AMFR codifica la GP78 umana (recettore del fattore autocrino di motilità), una ligasi E3 dell’ubiquitina ancorata al reticolo endoplasmatico (RE) che funge da componente centrale della degradazione associata al RE (ERAD), ubiquitinando le proteine mal ripiegate per la loro rimozione tramite il proteasoma. GP78 coopera con chaperoni del RE ed enzimi E2 per regolare il controllo qualità delle proteine, le risposte allo stress del RE e il turnover di specifici regolatori metabolici e di segnalazione. Attraverso i suoi ruoli nella proteostasi dipendente dall’ubiquitina e nella segnalazione associata alle membrane, l’attività di AMFR/GP78 è stata collegata a programmi di adattamento cellulare che influenzano proliferazione, migrazione e segnalazione dello stress infiammatorio. La disregolazione dell’ERAD e delle reti di ligasi dell’ubiquitina che coinvolgono GP78 è stata studiata in contesti quali la biologia dei tumori, la neurodegenerazione e modelli di malattie metaboliche, in cui lo squilibrio della proteostasi rappresenta un fattore contributivo.

GP78 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AMFR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GP78 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AMFR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AMFR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GP78. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AMFR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GP78 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GP78 nelle cellule tumorali con espressione di AMFR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.