GLP-1R Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400847-ACT

GLP1R codifica il recettore del peptide-1 simile al glucagone (GLP-1R), un GPCR di classe B che si accoppia principalmente a Gs per stimolare l’adenilato ciclasi, aumentare i livelli di cAMP e attivare le vie di segnalazione PKA ed EPAC. Nelle cellule β pancreatiche, la segnalazione di GLP-1R potenzia la secrezione di insulina stimolata dal glucosio e modula programmi genici legati al sensing dei nutrienti e alla capacità secretoria, mentre nei tessuti extra-pancreatici influenza circuiti regolatori neuronali e gastrointestinali. Il crosstalk tra vie a valle può coinvolgere la trascrizione dipendente da CREB, la segnalazione PI3K–AKT e processi calcio-dipendenti che modellano l’eccitabilità cellulare e la secrezione. Alterazioni dell’espressione o della segnalazione di GLP1R sono state studiate nel contesto della disregolazione metabolica, incluse caratteristiche associate a diabete e obesità, oltre che nelle risposte di stress delle cellule β.

GLP-1R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GLP1R senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GLP-1R Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GLP1R nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GLP1R, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GLP-1R. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GLP1R nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GLP-1R nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GLP-1R nelle cellule tumorali con espressione di GLP1R silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.