Plasmide CRISPR d'Activation (h) GLI-3: sc-400853-ACT

GLI3 code le facteur de transcription à doigts de zinc GLI-3, un effecteur central et un répresseur/activateur dépendant du contexte au sein de la voie de signalisation Hedgehog (HH). Grâce à un traitement protéolytique régulé et au contrôle transcriptionnel nucléaire, GLI-3 intègre les signaux issus des cils primaires et module des programmes de développement qui gouvernent la mise en place des patrons (patterning), le comportement des cellules souches/progénitrices et la morphogenèse tissulaire. Une activité dérégulée de GLI3 perturbe les réseaux d’expression des gènes cibles de HH et a été associée à des syndromes de malformations congénitales ainsi qu’à des phénotypes oncogéniques dépendants de la voie, dans lesquels la sortie transcriptionnelle HH–GLI est altérée. En tant que nœud transcriptionnel en aval de PTCH1/SMO, GLI-3 est largement utilisé pour étudier la dynamique de la voie HH, la signalisation ciliaire et la régulation transcriptionnelle dans des modèles cellulaires humains.

GLI-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GLI3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GLI-3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GLI3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GLI3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GLI-3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GLI3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GLI-3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GLI-3 dans les cellules tumorales présentant une expression de GLI3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.